- Microinyección de ADN en núcleo de ovocito
- Microinyección de ADN en pronúcleo o en citoplasma de cigoto (óvulo fecundado)
- Electroporación de cigoto
- Co-inyección en ovocitos de una mezcla de cabezas de espermatozoides y ADN exógeno
- Vectores virales
- Transfección de gametos
- Transferencia de núcleos transfectados (clonación)
Los animales transgénicos son organismos con genes de otros organismos (foráneos). El estudio de animales transgénicos tiene múltiples aplicaciones tanto en investigación básica como aplicada. Mucho de lo que hoy día se sabe sobre la regulación de genes específicos de tejido durante el desarrollo, en el adulto y en diversas patologías, proviene de experimentos realizados en moscas y ratones transgénicos; la obtención de productos farmacéuticos en la leche de animales de granja también se debe a esta tecnología; la creación de modelos animales que mimetizan enfermedades hereditarias humanas es otra de sus aplicaciones, así como la posibilidad de controlar la expresión de un transgén (gen introducido) en el espacio y en el tiempo.
Existen dos métodos fundamentales para la obtención de animales transgénicos: la microinyección de ADN a huevos fecundados y la introducción de ADN a embrioblastos del blastocisto. El primer método nos da una alta proporción de «transgénicos integrales», es decir, animales que han introducido el transgén en todas las células de su organismo, y más baja de «quimeras trans-génicas» o animales que sólo han sido modificados en algunos tejidos. Cuando uno de los tejidos afectados son las gónadas, al menos la mitad de la descendencia será transgénica integral. Las predicciones de segregación mendeliana en animales transgénicos pueden estar alteradas ya que rio sabemos «a priori» si se ha incorporado más de una copia del transgén, ni los lugares cromosómicos donde la inserción ha tenido lugar.
Microinyección de ADN a huevos fecundados
Entre los animales predilectos para la realización de este tipo de experimentos, están: el sapo africano (Xenopus laevis), la mosca del vinagre (Droso-phila melanogasler) y el ratón casero (Mus musculus).
Sapos transgénicos (Xenopus laevis, ei sapo africano) se obtienen fácilmente inyectando el ADN foráneo a huevos fecundados en el estadio de una o dos células. Una parte del ADN inyectado se integra en el genoma y se transmite a la siguiente generación. La expresión del transgén, sin embargo, no puede ser general, sino exclusiva en algunos tejidos y la colocación de un promotor-estimulador del propio xenopus específico de tejido, o embrionario, no garantiza su correcta expresión.
Drosophila melanogaster es otro de los organismos predilectos por lo bien que se conoce a nivel genético, citológico y de desarrollo. Drosophila posee cromosomas gigantes en las glándulas salivares, y los distintos estadios del desarrollo desde el embrión al adulto son externos (sin conexión con la madre), pudiendo manipularse fácilmente. La transferencia génica en Drosophila está ligada a los transposones o elementos P. Se trata de elementos móviles que sólo se encuentran en las cepas denominadas «P». Las cepas que carecen de elementos móviles se denominan «M». Hay de 30 a 50 copias por genoma. Cuando un genoma que posee elementos P (paternos) se fusiona con células germinales M (maternas), se estimula la transposición de estos elementos. Esto sólo ocurre en las células germinales del embrión resultante y origina una serie de efectos genéticos: 1) produce mutaciones, y 2) facilita la recombinación y los reordenamientos cromosómicos. Los embriones se desarrollan a moscas Fl que tienen muchas mutaciones y con frecuencia son estériles. El fenómeno se denomina disgénesis híbrida P-M, y la explicación más simple del proceso es que, en general, los elementos P reprimen su propia transposición por la presencia de un represor, pero la dilución del represor en el zigoto P/M dispara la función de movilidad. Las cepas M carecen tanto de elementos como de sus represores. La microinyección de elementos P en embriones M/M produce disgénesis híbrida. El elemento tiene 2,9 kb y 4 pautas abiertas de lectura (ORF, Open Reading Frames). La fusión de los 4 ORF da como producto una «trans-posasa» que interviene en el proceso de transposición. Entre el ORFO y el ORFt hay un intrón, y entre el 2 y el 3 otro (figura 1). El segundo intrón sólo se elimina en células germinales y no en células somáticas. Esto probablemente explica por qué la transposición es tejido-específica y sólo ocurre en células germinales. En sus extremos P tiene unos terminales invertidos repetidos de 31 pares de bases.
Se han elaborado vectores basados en elementos P en los que se han sustituido los genes del transposón por ei gen neo bacteriano que confiere resistencia a los antibióticos neomicina, kanamícina y G418. El gen se ha hecho indu-cible por temperatura a través del promotor de la proteína 70 de choque térmico.
Los transformantes se seleccionan incluyendo en la comida de las larvas 1 mg/ml del antibiótico G418, concentración normalmente tóxica. La ventaja de este sistema selectivo es que no hay que inspeccionar individualmente cada transformante; el inconveniente es que puede haber transformantes que no expresen el gen neo, o que los niveles de expresión no sean suficientes para conferir la resistencia deseada. Se puede usar cualquier otro marcador genético.
El vector ha de ser inyectado junto con un elemento P «auxiliar» que aporte los genes eliminados en el vector y qué son imprescindibles para la movilización. El embrión ha de ser de tipo M para permitir la transposición del elemento P inyectado. Inmediatamente después de la inyección el elemento P salta del vector, utilizando la «transposasa» que provee el elemento auxiliar en «trans». Puede ocurrir una o varias inserciones que se fijan y estabilizan en las siguientes generaciones (donde ya no hay transposasa).
La microinyección se lleva a cabo en la región polar del embrión que originará las células polares, que son las precursoras de la línea germinal. Los embriones se desarrollan hasta moscas adultas (GO = generación 0). En esta generación el vector P estará integrado únicamente en las células germínales, por lo que no interesa aún seleccionar por resistencia a G418. Los niveles de expresión serán muy bajos, al ser las células germinales las únicas capaces de expresar el gen introducido. Más aún; hay del orden de 30-50 células polares y puede que no todas hayan adquirido el elemento, constituyendo un mosaico o quimera transgénica. Los individuos de la GO se cruzan entre sí o con los padres para dar la F,. La selección se puede usar en las larvas F,. Sólo aquellos individuos que procedan de células germinales con elemento P serán transgénicos y suelen representar el IO por 100 de la progenie. Una cepa se establece y mantiene por cruzamientos con los padres o hermanos. El elemento P se integra al azar en el genoma de la célula embrionaria huésped. El lugar donde ha ocurrido la inserción puede ser identificado por hibridaciones in situ a los cromosomas politénicos de las larvas. Se puede utilizar como sonda radiactiva el elemento P y aparecerá un «precipitado» sobre la banda cromosómica donde haya tenido lugar la hibridación. Este método de hibridación in situ se ha utilizado para el aislamiento de genes colindantes o muy próximos a alguno de los lugares de integración del elemento P. Un pequeño «paseo cromosómico» nos llevará al gen deseado.
Mus musculus, el ratón casero, tiene grandes ventajas sobre cualquier otro mamífero para realizar experimentos de laboratorio. Su pequeño tamaño, resistencia a infecciones, carnadas de 4-8 ratoncitos y un período de gestación medio relativamente corto (19-20 días) lo convierten en el organismo predilecto para la inducción de transgénicos. El uso de ratones también está favorecido por la existencia de numerosas mutaciones que afectan al color de la piel (albino, negro, agutí, pardo, etc.). Hay varios métodos para introducir ADN heteró-logo en la línea germinal de ratones, que son, en general, aplicables a cualquier mamífero. Todas las técnicas se basan en el aislamiento de huevos fecundados o embriones tempranos, un breve cultivo in vitro para su manipulación y su reimplantación en «madres nodrizas» para que prosigan su desarrollo.
La microinyección de ADN es el método más eficiente. Consiste esencialmente en la introducción del ADN lineal que se desee insertar en pronúcleos de huevos de ratón fecundados.
La ovulación en el ratón ocurre de manera natural como respuesta a la cópula, pero puede inducirse por tratamiento con la hormona luteinizante. En la mayoría de los experimentos se induce a «superovulan> a ratones hembras por acción hormonal y se cruzan con machos adecuados. A las 22 horas del apareamiento se abren las ratonas para aislar los huevos fecundados de sus oviductos, los cuales se mantienen en un medio de cultivo.
Al microscopio se reconocen los huevos fecundados por la presencia claramente visible de sus dos pronúcleos. La inyección se realiza en el pronúcleo masculino, que es ligeramente más grande que el femenino. Con la llegada del ADN heterólogo, este pronúcleo aumenta aún más de volumen.
Con algo de práctica es posible inyectar unos 60 huevos por hora. El 80 por 100 de los huevos inyectados sobreviven al pinchazo. La reimplantación en madres nodrizas pseudopreñadas puede llevarse a cabo inmediatamente, o bien pueden cultivarse in vilro los huevos durante la noche (estadio de dos células) e implantarlos al dia siguiente. Se pseudopreñan ratonas jóvenes copulándolas con machos estériles y en cada una de ellas se depositan de 10 a 20 embriones. Sólo de la mitad a una tercera parte de los mismos llevan a término la gestación y, de nuevo, sólo de la mitad a un tercio de estos supervivientes son transgénicos
Estos transgénicos teóricamente deberían haber integrado el gen heterólo-go, en el genoma de todas las células del organismo (generación GO). Sin embargo, aproximadamente el 20 por 100 de los individuos inyectados producen «quimeras transgénicas», lo cual implica que la integración del ADN ha ocurrido en estadios algo posteriores al de ia inyección y no ha afectado a todos los tejidos del ratón.
El número de copias que se suelen integrar varía entre I y 200. Cuando son muchas, suelen formar concatémeros cabeza-cola y localizarse en un único sitio, aunque algunas veces, de modo extraordinario, pueden integrarse en varios sitios cromosómicos
La confirmación de que un individuo ha incorporado el ADN inyectado y es transgénico se obtiene analizando el ADN de todos los individuos de la progenie. Unas gotas de sangre son básicamente las muestras que se toman para extraer el ADN de cada transgénico potencia!. La primera progenie que se obtiene a partir de la microinyección constituye los «fundadores transgénicos» GO. En la mayoría de los casos el ADN adquirido se transmite como un carácter men-deliano y no es difícil establecer líneas estables de estos individuos.
Si los individuos de la GO se cruzan con la cepa paterna (retrocruzamiento) y el transgén se comporta como un carácter mendeliano, el 50 por 100 de su progenie será heterocigótico para el ADN insertado fhemicigóticos). Estos individuos constituyen la F, y una línea transgénica se puede mantener indefinidamente apareando hemicigóticos de la F, con individuos silvestres no trans-génicos. Alternativamente, individuos de la F, pueden cruzarse entre si para producir un 25 por !00 homocigóticos transgénicos, un 50 por 100 hemizigóti-cos y un 25 por 100 sin ADN heterólogo, siempre que el transgén no afecte a la viabilidad de la descendencia
Obtención de transgénicos por introducción de ADN a embrioblastos del blastocisto Es un método alternativo a la microinyección que produce transgénicos integrales a partir de quimeras transgénicas. Se puede aislar los blastocistos del útero materno entre 3,5 y 4,5 días después de la cópula. Del blastocisto se aislan células troncales totipotentes (embrioblastos o blastómeros), que se cultivan sobre una capa de células que actúan de soporte. La introducción del ADN puede realizarse por infección con retrovirus u otros tipos de transfección como la mediada por liposomas.
Las células troncales manipuladas son reinsertadas en un nuevo blastocisto y éste en una madre pseudopreñada por tratamiento hormonal y apareamiento con machos vasectomizados. Al cabo de unos 18 días aparecerá la GO, cuyos individuos transgénicos serán todos quimeras, que por retrocruzamiento con los padres darán lugar a la F, que a su vez se analizará para detectar la presencia de hemicigotos transgénicos. Un cruzamiento entre hermanos F, dará lugar a homocigotos transgénicos que permitirán establecer una línea pura. Sólo aquellos individuos cuyas células germinales hayan adquirido el gen inyectado en la GO serán transgénicos.
Para la infección con retrovirus se utilizan como células soporte, células productoras de retrovirus defectivos (derivados del virus Moloney de ratón) que lleven el transgén. La forma replicativa del retrovirus se integra en una sola copia, y si esto ocurre en células de la línea germinal, el provirus se transmite como un carácter mendeliano. A veces existen problemas con la expresión de genes introducidos en uno de estos vectores retrovíricos, debido a metilación de su ADN y, por tanto, bloqueo de su expresión. Las secuencias del huésped que flanquean el lugar de inserción del virus también son metiladas e inactivadas. Esta metilación puede desaparecer en períodos posteriores del desarrollo del animal, y la expresión variará dependiendo de la localización cro-mosómica donde se encuentre. Como la integración ocurre en un lugar distinto en cada embrioblasto, la expresión diferirá de célula a célula en el blastocisto receptor.
No siempre se controla el sexo de los embrioblastos donantes y receptores, por lo que se pueden añadir blastómeros masculinos a blastocistos de hembras, provocando una quimera sexual en la que ocurrirá un cambio de sexo (XX —* XY), si las células XY forman la mayoría de los tejidos en el embrión que contribuyen a la determinación del sexo. También puede aparecer un individuo herma-frodita con órganos sexuales masculinos y femeninos.
La utilización de células troncales totipotentes embrionarias tiene una ventaja fundamental frente a la microinyección y es la posibilidad de seleccionar in vitro aquellas células que han incorporado el transgén, antes de su reincorporación a un blastocisto. La selección nos permite obtener animales transgé-nicos producidos por recombinación homologa y dianas génicas, algo que no podemos llevar a cabo por microinyección en huevos fecundados.
Referencia: les debo la referencia del libro (por ahora no lo tengo a la mano)
