Trastorno autista

En 1943 el Dr. Leo Kanner, un psiquiatra de la universidad John Hopkins, escribió la primera ponencia aplicando el término autismo a un grupo de niños ensimismados y con severos problemas de índole social, de comportamiento y de comunicación.

El autismo se considera un trastorno generalizado del desarrollo comienza en la infancia, y supone incapacidades importantes en prácticamente todas las áreas psicológicas y conductuales. Este síndrome se hace evidente durante los primeros 30 meses de vida y da lugar a diferentes grados de alteración del lenguaje y la comunicación, de las competencias sociales y de la imaginación y con frecuencia, estos síntomas se acompañan de comportamientos anormales.

La definición del DSM-IV subraya especialmente el deterioro de las interacciones sociales, los problemas de comunicación verbal y no verbal (y las habilidades que se relacionan, tales como la simbolización), así como la limitada gama de actividades e intereses. El trastorno autista se presenta con un amplio espectro de gravedad.

Aunque no se han determinado aún las causas del autismo, se han desarrollado un gran número de teorías, con mayor o menor validez explicativa, que desde los diferentes enfoques y modelos intentan aproximarse a las raíces de este trastorno. Las teorías explicativas que imperan hoy día sobre la etiología del autismo se pueden agrupar en dos grandes áreas. El primer grupo de hipótesis hace referencia a los factores genéticos y cromosómicos y a las variables neurobiológicas. El segundo integra las hipótesis que enfatizan los aspectos psicológicos (afectivos, cognitivos, sociales) que subyacen al comportamiento autista. Estos dos grupos de hipótesis explicativas no son incompatibles entre sí.

A nivel genético, actualmente se admite la presencia de una alteración genética en el 10-20% de los casos de autismo. Los resultados apuntan a la existencia de diversas anomalías en el cariotipo de algunos autistas, en los que se ha detectado alteraciones en la mayor parte de los pares cromosómicos (excepto en el 7, 14, 19 y 20), evidenciando una falta de sustancia en el extremo distal del brazo largo del cromosoma X que afecta a ambas cromátides. Esta alteración fue asociada por primera vez con el autismo en el trabajo de H. A. Lubs (1969). En los estudios familiares existen indicios de herencia autosómica recesiva en determinados casos de trastorno autista.

En algunos individuos se puede identificar una causa médica específica. Hay una alta incidencia de problemas tempranos del desarrollo como infecciones neurológicas postnatales, rubéola congénita y fenilcetonuria.

En los cinco últimos años, algunos estudios han mostrado que muchos individuos con conducta autista tienen trastornos relacionados pero distintos. Estos incluyen: el síndrome de Asperger, el síndrome de la X frágil y el síndrome de Rett. Los trastornos convulsivos aparecen entre el 15 y el 50% a la edad de 20 años.

Las personas con el síndrome de Landau-Kleffner también muestran muchas conductas autistas, tal como la introversión, la insistencia en la uniformidad y los problemas de lenguaje. Con frecuencia se considera que estos individuos tienen autismo "regresivo" porque parecen ser normales hasta como entre los 3 y 7 años de edad. Suelen hablar bien desde muy pequeños pero paulatinamente pierden esta su capacidad.

El síndrome de Williams se caracteriza por varias conductas autistas incluyendo: retrasos del desarrollo y del lenguaje, hipersensibilidad al sonido, trastornos de atención, y problemas de índole social. En contraste con muchos individuos autistas, aquellos con el síndrome de Williams son bastante sociables y padecen problemas cardíacos.

Respecto a la estructura cerebral, se han localizado dos zonas en el sistema límbico que están subdesarrolladas, la amígdala y el hipocampo. Estas dos zonas son responsables por las emociones, la agresión, los estímulos sensoriales y el aprendizaje. Estos investigadores también encontraron una deficiencia de células de Purkinje en el cerebelo. Utilizando Resonancia Magnética, se ha encontrado dos zonas en el cerebelo, los lóbulos del vérmix VI y VII, que son significativamente más pequeños en los individuos autistas que en los normales. Se cree que una o ambas de esas zonas del cerebelo son responsables de la concentración. La tomografía por emisión de positrones (TEP) ha mostrado un incremento del metabolismo de la glucosa en muchas regiones cerebrales.

Las pruebas neuropsicológicas muestran hallazgos positivos. El CI bajo se asocia a una mayor incidencia de crisis, deterioro social, conductas extrañas y automutilación, y a un pronóstico menos favorable. Existe un desarrollo tardío de la dominancia cerebral y un número mayor de individuos que no presentan dominancia lateral derecha, reflejos neurológicos primitivos, signos neurológicos débiles y anomalías físicas.

Las pruebas neuroquímicas sugieren un descenso en las catecolaminas urinarias (y metabolitos relacionados) y un aumento en el metabolito de la dopamina (HVA) en el líquido cefalorraquídeo.
Existen también datos que apoyan la implicación de los péptidos opiáceos en el trastorno autista, algunos individuos tienen niveles elevados de beta-endorfinas, se supone que aquellos con una tolerancia aumentada al dolor.

En un tercio de los pacientes con autismo, existe un aumento en la serotonina de la sangre, que parece ser un rasgo estable que permanece presente durante décadas. El elevado nivel de serotonina en la sangre no parece estar relacionado con características clínicas específicas.

Un sistema inmune disfuncional también se ha asociado con el autismo. Se piensa que una infección viral o una toxina ambiental pueden ser responsables por daños al sistema inmune. Los investigadores han encontrado que muchos individuos autistas tienen una cantidad disminuida de linfocitos T cooperadores, que ayudan al sistema inmune a combatir la infección. Así se piensa que existe un riesgo aumentado de tener un hijo autista si la madre estuvo expuesta al virus de la rubéola durante el primer trimestre del embarazo. El citomegalovirus también se ha asociado con autismo. Además, se especula que los virus asociados con las vacunas como el de la vacuna contra la rubéola y el componente pertussis de la inyección DPT, pueden causar autismo.

Se ha sugerido una excesiva representación de los diferentes trastornos autoinmunes y anomalías inmunitarias, publicándose un informe sobre la presencia de autoanticuerpos de los receptores serotoninérgicos 1A (no de los receptores serotoninérgicos 1B, ni de los receptores 2) en el líquido cefalorraquídeo y en la sangre, del 40% de los pacientes autistas, que no están presentes en los pacientes con lesiones cerebrales o en pacientes normales.

Referencia: http://www.biopsicologia.net/

Bacteriofagos

Los fagos como agentes de virulencia: lisis y lisogenia.

Algunos bacteriófagos son capaces de integrarse en el cromosoma bacteriano durante largos periodos de tiempo y su material genético se multiplica al mismo tiempo que lo hace el DNA de la bacteria huésped. A esta situación se le conoce como estado de lisogenia, al fago que posee esta propiedad se le denomina fago atemperado y a la bacteria que presenta esta característica biológica se le llama bacteria lisogénica.

En contraste, el fago lítico se limita a multiplicar su DNA o RNA, una vez que infecta a la bacteria, para producir nueva descendencia fágica que finaliza con la destrucción de la célula bacteriana y la consecuente liberación de la progenie. Los fagos atemperados contienen algunos genes que pueden expresarse en la bacteria lisogénica y así contribuir a su virulencia bacteriana y, en algunos casos ser los únicos responsables de la misma. Existen ejemplos muy conocidos históricamente para ilustrar esta situación como son los casos de la escarlatina y la toxina diftérica. En la actualidad este control de la virulencia bacteriana via fagos se ha visto ampliado en numerosos casos entre los que cabe citar conocidos ejemplos de bacterias patógenas tales como los agentes etiológicos del cólera, el botulismo, la difteria y tantos otros sistemas donde los fagos atemperados son los encargados de codificar para las toxinas más deletereas implicadas en estas enfermedades.

Las enzimas líticas fágicas como antibióticos: enzibióticos.

Tomados en su conjunto la serie de análisis genéticos, bioquímicos y, más recientemente, cristalográficos, que se han realizado con las enzimas líticas de neumococo y sus fagos, nos han proporcionado una sólida base molecular para explicar la conocida especificidad de las lisinas fágicas. Es decir, estas enzimas líticas matan específicamente solo a las bacterias en que fueron sintetizados los fagos, o a especies próximas, valiendose, en cada caso, del peculiar reconocimiento que hace la proteína de ciertos componentes estructurales presentes en su diana en la pared celular. En el modelo de neumococo, las lisinas fágicas verían facilitada su función por la presencia de colina en los ácidos teicoicos presentes en la pared de esta bacteria.
Partiendo de esta idea, ha surgido recientemente una brillante variante experimental a la llamada terápia fágica donde se hace uso de algunos productos fágicos. Me refiero al empleo de las enzimas líticas producidas por fagos con fines terapéuticos.

Perspectivas futuras

Lo cual resulta en una esperanzadora alternativa para desarrollar nuevas aproximaciones terapéuticas que puedan servir para paliar las alarmantes resistencias que van adquiriendo las bacterias en general y neumococo en particular, frente al arsenal de antibióticos de que disponemos en la actualidad. No olvidemos que los fagos son las entidades más abundantes en la naturaleza, se ha estimado que existen, nada menos que, 1031 particulas fágicas en el planeta, lo cual representa un pool de agentes biológicos con una potencialidad aún inexplorada para el control de los patógenos humanos.

Los detractores de esta técnica aducen que es más fácil desarrollar resistencia frente a estos enzibióticos que mediante el empleo de cócteles de fagos, como se planteó anteriormente, aunque hasta ahora no se han detectado bacterias resistentes frente a las enzimas líticas. Otro problema que se suele esgrimir, en este caso, ya sea en contra del empleo de la terapia fágica o del uso de los enzibióticos es el de la producción de anticuerpos neutralizantes. Parece ser que la administración parenteral de fagos da lugar al desarrollo de anticuerpos. Sin embargo, no se ha demostrado si se generan anticuerpos cuando se utiliza la vía oral o tópica para la curación con fagos y se ignora el tiempo de permanencia de tales anticuerpos en el torrente sanguíneo. Finalmente el desarrollo de resistencias bacterianas frente a los fagos, aunque se considera que es 10 veces mas bajo que el desarrollo de resistencias frente a los antibióticos, se podría evitar mediante el empleo de cócteles de fagos a manera del uso simultaneo que se hace de 2 ó 3 antibióticos. Dado que los fagos son entidades que se encuentran en el medio ambiente, que se consumen en los alimentos y que conviven en los organismos animales, se piensa que el desarrollo de anticuerpos neutralizantes no sería en teoría un obstaculo durante el tratamiento inicial de infecciones agudas ya que la cinética de acción de los fagos y de las enzimas líticas es más rápida que la producción de anticuerpos neutralizantes por parte del huésped. Además, la carencia de toxicidad de las enzimas líticas y la observación de que el suero hiperinmune no neutraliza a estas enzimas en el modelo murino son un estimulo para futuras investigaciones que, sin duda, precisan ser verificadas en el ser humano.

Se ha pronosticado con sobradas razones que es posible que hayamos vuelto en el caso de ciertas enfermedades infecciosas a la era preantibiótica. Es indudable que a la luz de nuestros conocimientos actuales aquellas condiciones que faciliten una rápida multiplicación fágica son las que proporcionarían una adecuada eliminación del patógeno, como ocurre en la mucosa intestinal y en la piel mientras que en infecciones donde el fago encuentre dificultades para su multiplicación, debido a la existencia de un excesivo número de células (abscesos) o por inconvenientes físicos, al tratarse de bacterias de multiplicación intracelular, se duda de su eficacia. En lo que existe acuerdo generalizado es en que tanto con el empleo de fagos como de alguno de los productos por ellos generados, estamos ante terapias novedosas y prometedoras que usadas como alternativa a los antibióticos pueden proporcionar un medio muy eficaz para combatir el preocupante problema que existe con el desarrollo de bacterias resistentes frente a todo el arsenal antibiótico de que se dispone. Todo esto propicia un escenario que garantiza estudios futuros en el campo de la terapia fágica. En conclusión, existe una consistente aportación bibliográfica y experimental que avala el continuar investigando el potencial uso de los fagos y de sus productos génicos como una esperanzadora alternativa, o como un complemento terapéutico a los tratamientos de que se dispone actualmente.

Referencia:

http://www.racve.es/actividades/medicina-veterinaria/2004-11-03RubenLopez.htm

Bacteriófagos: de la Biología molecular a su uso terapéutico

Rubens López
Departamento de Microbiología Molecular, Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), Ramiro de Maeztu 9, Campus de la Universidad Complutense de Madrid, 28040. Madrid

TERAPIA GÉNICA EN PROCESOS TUMORALES

Terapia con genes suicidas o inductores de apoptosis

Los proyectos de terapia génica, que se basan en reemplazar aquellos genes supresores defectivos o en la introducción de genes suicidas o inductores de apoptosis, hay ya numerosos protocolos y estudios experimentales. Destacan especialmente, los que bien mediante vectores retrovirales o adenovirales intentan sobreexpresar p53 en las células tumorales e inducir apoptosis en las mismas. Asimismo, son muy prometedores los ensayos con genes suicidas, como el gen de la timidina quinasa, que independientemente de las alteraciones oncogénicas de las células tumorales son capaces de inducir muerte celular en todas aquellas que los han integrado.

La transferencia de genes citotóxicos (llamados suicidas) a células tumorales es también conocida como GDEPT (Gene Directed Enzyme Prodrug Therapy). Los genes suicidas son genes codificantes para proteínas tóxicas para la célula a la que se dirige. Este se puede realizar directamente, al utilizar genes que codifican para ciertas toxinas (ricina, toxina difterica, de pseudomonas, etc.). El principal inconveniente de esta estrategia es elaborar virus que introduzcan este gen en la célula tumoral a destruir, únicamente.

Actualmente se están intentando dirigir, mediante el uso de promotores específicos de algún tipo de tejido o inducibles (por hormonas, etc.). También se puede realizar indirectamente (sistema enzima / tóxico condicional), ya que el gen suicida codifica para una enzima que pasa un compuesto inactivo a una molécula tóxica. El ejemplo clásico de gen suicida es el de la quinasa de timidina de Herpes simplex (tk-HSV1). Esta enzima se encarga de fosforilar la timidina para dar deoxitimidin monofosfato (dMTP).

La quinasa de Herpes no es tan estricta como su homóloga en las células, ya que la quinasa viral es casi 1000 veces más eficiente que la celular y seria capaz de fosforilar también a los análogos de guanina, como serian el ganciclovir (GCV) o el aciclovir; de este modo, los compuestos pueden ser incorporados en la molécula de DNA, paralizando la replicación y provocando la muerte celular. Sólo aquellas células que hayan sido capaces de adquirir la quinasa viral, convertirán el GCV aun substrato monofosfato, capaz de seguir siendo fosforilado hasta la forma trifosfato, por la quinasa celular y así en esa forma puede ser incorporado en el DNA de las células en división, con la consiguiente muerte por apoptosis.

Una característica conocida de los retrovirus, es el que infectan exclusivamente células en división. El cerebro de adulto es uno de estos órganos en los que no hay divisiones celulares en condiciones normales. Tras unos experimentos iniciales en los que se demostró el efecto tóxico del gen tk-HSV1 por Moolten en 1986, en 1991, Ezzedine y col., utilizaron un vector retroviral para generar una línea celular de glioblastoma que expresara la tk-HSV1. Posteriormente se demostró que la transducción retroviral de un tumor era mucho más eficaz por inyección directa intratumoral de una línea celular productora de retrovirus que si se inyectaban sólo sobrenadantes. Así los retrovirus portadores del gen tk se introdujeron en células empaquetadoras murinas y estas a su vez en el seno de un tumor cerebral; al cabo de unos días se inicia el tratamiento con GCV, capaz de inducir el suicidio de todas las células tumorales que hayan adquirido el gen viral. En algunos ensayos clínicos se han tratado pacientes con gliomas inoperables. Mediante inyección estereotáxica se introdujeron retrovirus que expresan este gen directamente en el tumor y a continuación se les dio a los pacientes GCV sistémico.

En 5 de los 8 pacientes se observó repuesta antitumoral durante mas de un año. El sistema tk-HSV1/GCV ha sido aplicado al tratamiento de otro tipo de tumores, como a metástasis del hígado, carcinoma de cabeza y cuello, melanoma maligno y hepatomas.

Otro sistema suicida utilizado comúnmente en terapia génica es el de la citosina deaminasa (CD)/5-fluorocitosina. La CD (bacteriana ó fúngica), pasa del compuesto 5-fluorocitosina (usado normalmente como quimioterápico, para el tratamiento del cáncer) en el tóxico 5-fluorouracilo. Además se están investigando otra serie de genes suicidas, como la tk de varicela zoster, fosforilasa de nucleósidos de purina de E. Coli, Citocromo P450, activador de la ciclofosfamida, Nitroreductasa de E. coli. Una de las mayores ventajas que presenta esta aproximación esta basada en lo que se conoce como el efecto bystander. Se entiende por tal al hecho de conseguir la regresión total de un tumor cuando sólo una parte de las células han sido modificadas con el gen en cuestión. De este modo, las células tk+ podían inducir la muerte de las células tk- adyacente. Únicamente con el l0% de las células infectadas, bastaría para observar grandes efectos en el tumor inclusive con bajos niveles de expresión en estas, lo cual sin duda confiere un gran atractivo a este método.

Referencia:
TERAPIA GÉNICA EN PROCESOS TUMORALES
DR. SANTIAGO RAMÓN Y CAJAL
DR. RICARDO SÁNCHEZ-PRIETO
Unidad de Patología Molecular.
Departamento de Anatomía Patológica
Clínica Puerta de Hierro. Madrid

Terapia genica

Una de las propiedades más eficientes de los virus es la de integrar los genes virales dentro del material genético de la célula infectada y así utilizar la maquinaria celular para reproducir las partículas virales.

El avance en el conocimiento de la biología de los virus ha permitido el uso de esta propiedad para desarrollar virus que puedan transportar genes de interés terapéutico, o vectores virales, para terapia genética. Los vectores virales más utilizados son los retrovirus, los adenovirus, los virus asociados a adenovirus y los virus herpes simplex.

Cada grupo de vectores virales presenta determinadas ventajas y desventajas que los hace apropiados para diversos tipos de aplicaciones. Así, los retrovirus se integran en forma permanente en las células infectadas con el virus, sin embargo, requieren que estas células estén dividiéndose. Los adenovirus pueden transportar genes de largo tamaño, pero la expresión in vivo es transitoria. El virus de herpes simplex tiene especificidad por células del sistema nervioso, aunque con cierto potencial citotóxico.

Diversos grupos están estudiando diferentes combinaciones de virus para poder utilizar las ventajas y eliminar desventajas. Las aplicaciones de los vectores virales para terapia genética son diversas e incluyen el cáncer, el SIDA, la fibrosis quística, enfermedades metabólicas y otras enfermedades genéticas.

La terapia genética es uno de los más importantes conceptos de la medicina desarrollados durante la última década. La terapia genética consiste en el uso de genes escogidos y diseñados con el propósito de corregir o modificar funciones celulares y así ayudar al tratamiento de enfermedades congénitas o adquiridas.

El desarrollo de una estrategia de terapia genética necesita de la consideración de cuatro elementos: la enfermedad que se quiere intervenir, el gen terapéutico, el vector que se desea emplear y las células o tejidos que van a ser modificados.

Para introducir genes terapéuticos a las células se han desarrollado diversos vectores, los cuales son clasificados en vectores virales o no virales. Los vectores no virales utilizan moléculas coadyuvantes que facilitan el ingreso de ácidos nucleicos a las células, tales como lípidos o ligandos que se unen específicamente a receptores de la membrana celular. Los vectores virales aprovechan las estrategia desarrolladas evolutivamente por los virus para poder propagarse en las células infectadas. Son los más utilizados, debido a la eficiencia de la transferencia de genes, en comparación con los vectores no virales.

Los vectores virales son construidos haciendo que estos sean deficientes para la replicación, pero conservando las propiedades que permiten la expresión de los genes que llevan. Los virus utilizados con mayor frecuencia en protocolos de terapia genética son: los retrovirus, los adenovirus, los virus asociados a adenovirus (VAA) y los virus de herpes simplex. A continuación revisaremos estos vectores virales, con énfasis en aquellos basados en los retrovirus, y algunos ejemplos de las aplicaciones de la terapia genética.

VENTAJAS y DESVENTAJAS de los PRINCIPALES VECTORES VIRALES para TERAPIA GENETICA

Retrovirus
Ventajas:
- Estabilidad a largo plazo
- No induce inmunidad
- Biología bien estudiada
Desventajas:
- Transduce células en división

Adenovirus
Ventajas:
- Gran capacidad para genes largos
-Transduce células que no están en división
- Altos títulos obtenibles
Desventajas:
- Expresión genética es transiente
- Respuesta inmune significativa

Virus asociados a adenovirus
Ventajas:
- No causa enfermedad
- Sitio de integración específico
- Expresión estable
Desventajas:
- Poca capacidad para el tamaño del gen terapeútico

Virus de Herpes Simple
Ventajas:
- Transduce células que no están en división
- Gran capacidad para genes largos
- Eficiente para neuronas
Desventajas:
- Citotoxicidad en células infectadas
- Expresión genética transientes


Fuente: http://www.fihu-diagnostico.org.pe/revista/numeros/2000/novdic00/323-328.html
Vectores virales para terapia genética publicado por: Dr. Javier Chinén, MD, PhD

Problemas y aplicaciones de la transgenesis

• PROBLEMAS:

La introducción de una nueva información genética (el transgén) dentro del genoma de un organismo puede presentar algunos problemas en relación a dónde y cuándo expresar el transgén, tal como se indica a continuación:

- Integración múltiple (en tándem o no)
- Lugar de integración indeterminado (efecto de posición)
- Metilación y falta de expresión
- Mosaicismo (germinal y somático)
- Expresión específica/ectópica
- Expresión variable
- Expresión variable dentro de líneas (variegación)

En cualquier caso, el ideal sería poder dirigir con total precisión el lugar de integración del transgén. Así, por ejemplo, en 1999 se obtuvieron en el Roslin Institute de Edinburgo las ovejas transgénicas "Cupid" y "Diana" a partir de la clonación de cultivos celulares modificados mediante recombinación homóloga ("gene targeting").

• APLICACIONES:

La Biotecnología por ejemplo, incluye "cualquier técnica que utilice organismos vivos o parte de los organismos para fabricar o modificar productos, mejorar plantas o animales o desarrollar microorganismos para usos específicos" (Rodríguez-Villanueva, 1986).

La potencialidad de la biotecnología estriba en producir cantidades ilimitadas de:

- Substancias de las que nunca se había dispuesto con anterioridad
- Productos que se obtenían en pequeñas cantidades
- Abaratamiento de los costes de producción
- Mayor seguridad en los productos obtenidos
- Nuevas materias primas, más abundantes y menos caras

Dentro de este contexto general, la Biotecnología ha incorporado la transgénesis animal con los fines que se indican a continuación:

- Mejora de caracteres productivos
- Resistencia a enfermedades
- Modelos animales de enfermedades humanas (por ejemplo, ratones knockout)
- Animales transgénicos como biorreactores para la síntesis de proteínas de alto valor (proteínas terapéuticas): Las "granjas farmacéuticas" o "granjas moleculares".
- Donación de órganos: Xenotransplantes

Tecnicas de obtencion de transgenicos

- Microinyección de ADN en núcleo de ovocito
- Microinyección de ADN en pronúcleo o en citoplasma de cigoto (óvulo fecundado)
- Electroporación de cigoto
- Co-inyección en ovocitos de una mezcla de cabezas de espermatozoides y ADN exógeno
- Vectores virales
- Transfección de gametos
- Transferencia de núcleos transfectados (clonación)

Los animales transgénicos son organismos con genes de otros organismos (foráneos). El estudio de animales transgénicos tiene múltiples aplicaciones tanto en investigación básica como aplicada. Mucho de lo que hoy día se sabe sobre la regulación de genes específicos de tejido durante el desarrollo, en el adulto y en diversas patologías, proviene de experimentos realizados en mos­cas y ratones transgénicos; la obtención de productos farmacéuticos en la leche de animales de granja también se debe a esta tecnología; la creación de mode­los animales que mimetizan enfermedades hereditarias humanas es otra de sus aplicaciones, así como la posibilidad de controlar la expresión de un transgén (gen introducido) en el espacio y en el tiempo.

Existen dos métodos fundamentales para la obtención de animales transgé­nicos: la microinyección de ADN a huevos fecundados y la introducción de ADN a embrioblastos del blastocisto. El primer método nos da una alta propor­ción de «transgénicos integrales», es decir, animales que han introducido el transgén en todas las células de su organismo, y más baja de «quimeras trans-génicas» o animales que sólo han sido modificados en algunos tejidos. Cuando uno de los tejidos afectados son las gónadas, al menos la mitad de la descen­dencia será transgénica integral. Las predicciones de segregación mendeliana en animales transgénicos pueden estar alteradas ya que rio sabemos «a priori» si se ha incorporado más de una copia del transgén, ni los lugares cromosómicos donde la inserción ha tenido lugar.

Microinyección de ADN a huevos fecundados

Entre los animales predilectos para la realización de este tipo de experi­mentos, están: el sapo africano (Xenopus laevis), la mosca del vinagre (Droso-phila melanogasler) y el ratón casero (Mus musculus).

Sapos transgénicos (Xenopus laevis, ei sapo africano) se obtienen fácilmen­te inyectando el ADN foráneo a huevos fecundados en el estadio de una o dos células. Una parte del ADN inyectado se integra en el genoma y se transmite a la siguiente generación. La expresión del transgén, sin embargo, no puede ser general, sino exclusiva en algunos tejidos y la colocación de un promotor-esti­mulador del propio xenopus específico de tejido, o embrionario, no garantiza su correcta expresión.

Drosophila melanogaster es otro de los organismos predilectos por lo bien que se conoce a nivel genético, citológico y de desarrollo. Drosophila posee cromosomas gigantes en las glándulas salivares, y los distintos estadios del de­sarrollo desde el embrión al adulto son externos (sin conexión con la madre), pudiendo manipularse fácilmente. La transferencia génica en Drosophila está ligada a los transposones o elementos P. Se trata de elementos móviles que sólo se encuentran en las cepas denominadas «P». Las cepas que carecen de ele­mentos móviles se denominan «M». Hay de 30 a 50 copias por genoma. Cuan­do un genoma que posee elementos P (paternos) se fusiona con células germi­nales M (maternas), se estimula la transposición de estos elementos. Esto sólo ocurre en las células germinales del embrión resultante y origina una serie de efectos genéticos: 1) produce mutaciones, y 2) facilita la recombinación y los reordenamientos cromosómicos. Los embriones se desarrollan a moscas Fl que tienen muchas mutaciones y con frecuencia son estériles. El fenómeno se de­nomina disgénesis híbrida P-M, y la explicación más simple del proceso es que, en general, los elementos P reprimen su propia transposición por la pre­sencia de un represor, pero la dilución del represor en el zigoto P/M dispara la función de movilidad. Las cepas M carecen tanto de elementos como de sus represores. La microinyección de elementos P en embriones M/M produce dis­génesis híbrida. El elemento tiene 2,9 kb y 4 pautas abiertas de lectura (ORF, Open Reading Frames). La fusión de los 4 ORF da como producto una «trans-posasa» que interviene en el proceso de transposición. Entre el ORFO y el ORFt hay un intrón, y entre el 2 y el 3 otro (figura 1). El segundo intrón sólo se elimina en células germinales y no en células somáticas. Esto probablemente explica por qué la transposición es tejido-específica y sólo ocurre en células germinales. En sus extremos P tiene unos terminales invertidos repetidos de 31 pares de bases.

Se han elaborado vectores basados en elementos P en los que se han susti­tuido los genes del transposón por ei gen neo bacteriano que confiere resisten­cia a los antibióticos neomicina, kanamícina y G418. El gen se ha hecho indu-cible por temperatura a través del promotor de la proteína 70 de choque térmico.

Los transformantes se seleccionan incluyendo en la comida de las larvas 1 mg/ml del antibiótico G418, concentración normalmente tóxica. La ventaja de este sistema selectivo es que no hay que inspeccionar individualmente cada transformante; el inconveniente es que puede haber transformantes que no ex­presen el gen neo, o que los niveles de expresión no sean suficientes para con­ferir la resistencia deseada. Se puede usar cualquier otro marcador genético.

El vector ha de ser inyectado junto con un elemento P «auxiliar» que aporte los genes eliminados en el vector y qué son imprescindibles para la moviliza­ción. El embrión ha de ser de tipo M para permitir la transposición del elemen­to P inyectado. Inmediatamente después de la inyección el elemento P salta del vector, utilizando la «transposasa» que provee el elemento auxiliar en «trans». Puede ocurrir una o varias inserciones que se fijan y estabilizan en las si­guientes generaciones (donde ya no hay transposasa).

La microinyección se lleva a cabo en la región polar del embrión que origi­nará las células polares, que son las precursoras de la línea germinal. Los embriones se desarrollan hasta moscas adultas (GO = generación 0). En esta generación el vector P estará integrado únicamente en las células germínales, por lo que no interesa aún seleccionar por resistencia a G418. Los niveles de expresión serán muy bajos, al ser las células germinales las únicas capaces de expresar el gen introducido. Más aún; hay del orden de 30-50 células polares y puede que no todas hayan adquirido el elemento, constituyendo un mosaico o quimera transgénica. Los individuos de la GO se cruzan entre sí o con los padres para dar la F,. La selección se puede usar en las larvas F,. Sólo aquellos individuos que procedan de células germinales con elemento P serán transgénicos y suelen representar el IO por 100 de la progenie. Una cepa se establece y mantiene por cruzamientos con los padres o hermanos. El elemento P se integra al azar en el genoma de la célula embrionaria huésped. El lugar donde ha ocurrido la inserción puede ser identificado por hibridacio­nes in situ a los cromosomas politénicos de las larvas. Se puede utilizar como sonda radiactiva el elemento P y aparecerá un «precipitado» sobre la banda cromosómica donde haya tenido lugar la hibridación. Este método de hibrida­ción in situ se ha utilizado para el aislamiento de genes colindantes o muy próxi­mos a alguno de los lugares de integración del elemento P. Un pequeño «paseo cromosómico» nos llevará al gen deseado.

Mus musculus, el ratón casero, tiene grandes ventajas sobre cualquier otro mamífero para realizar experimentos de laboratorio. Su pequeño tamaño, resis­tencia a infecciones, carnadas de 4-8 ratoncitos y un período de gestación me­dio relativamente corto (19-20 días) lo convierten en el organismo predilecto para la inducción de transgénicos. El uso de ratones también está favorecido por la existencia de numerosas mutaciones que afectan al color de la piel (albi­no, negro, agutí, pardo, etc.). Hay varios métodos para introducir ADN heteró-logo en la línea germinal de ratones, que son, en general, aplicables a cualquier mamífero. Todas las técnicas se basan en el aislamiento de huevos fecundados o embriones tempranos, un breve cultivo in vitro para su manipulación y su reimplantación en «madres nodrizas» para que prosigan su desarrollo.

La microinyección de ADN es el método más eficiente. Consiste esencial­mente en la introducción del ADN lineal que se desee insertar en pronúcleos de huevos de ratón fecundados.

La ovulación en el ratón ocurre de manera natural como respuesta a la có­pula, pero puede inducirse por tratamiento con la hormona luteinizante. En la mayoría de los experimentos se induce a «superovulan> a ratones hembras por acción hormonal y se cruzan con machos adecuados. A las 22 horas del aparea­miento se abren las ratonas para aislar los huevos fecundados de sus oviductos, los cuales se mantienen en un medio de cultivo.

Al microscopio se reconocen los huevos fecundados por la presencia clara­mente visible de sus dos pronúcleos. La inyección se realiza en el pronúcleo masculino, que es ligeramente más grande que el femenino. Con la llegada del ADN heterólogo, este pronúcleo aumenta aún más de volumen.

Con algo de práctica es posible inyectar unos 60 huevos por hora. El 80 por 100 de los huevos inyectados sobreviven al pinchazo. La reimplantación en madres nodrizas pseudopreñadas puede llevarse a cabo inmediatamente, o bien pueden cultivarse in vilro los huevos durante la noche (estadio de dos células) e implantarlos al dia siguiente. Se pseudopreñan ratonas jóvenes copulándolas con machos estériles y en cada una de ellas se depositan de 10 a 20 embriones. Sólo de la mitad a una tercera parte de los mismos llevan a término la gestación y, de nuevo, sólo de la mitad a un tercio de estos supervivientes son transgénicos

Estos transgénicos teóricamente deberían haber integrado el gen heterólo-go, en el genoma de todas las células del organismo (generación GO). Sin em­bargo, aproximadamente el 20 por 100 de los individuos inyectados producen «quimeras transgénicas», lo cual implica que la integración del ADN ha ocurri­do en estadios algo posteriores al de ia inyección y no ha afectado a todos los tejidos del ratón.

El número de copias que se suelen integrar varía entre I y 200. Cuando son muchas, suelen formar concatémeros cabeza-cola y localizarse en un único si­tio, aunque algunas veces, de modo extraordinario, pueden integrarse en varios sitios cromosómicos

La confirmación de que un individuo ha incorporado el ADN inyectado y es transgénico se obtiene analizando el ADN de todos los individuos de la proge­nie. Unas gotas de sangre son básicamente las muestras que se toman para ex­traer el ADN de cada transgénico potencia!. La primera progenie que se obtiene a partir de la microinyección constituye los «fundadores transgénicos» GO. En la mayoría de los casos el ADN adquirido se transmite como un carácter men-deliano y no es difícil establecer líneas estables de estos individuos.

Si los individuos de la GO se cruzan con la cepa paterna (retrocruzamiento) y el transgén se comporta como un carácter mendeliano, el 50 por 100 de su progenie será heterocigótico para el ADN insertado fhemicigóticos). Estos in­dividuos constituyen la F, y una línea transgénica se puede mantener indefini­damente apareando hemicigóticos de la F, con individuos silvestres no trans-génicos. Alternativamente, individuos de la F, pueden cruzarse entre si para producir un 25 por !00 homocigóticos transgénicos, un 50 por 100 hemizigóti-cos y un 25 por 100 sin ADN heterólogo, siempre que el transgén no afecte a la viabilidad de la descendencia

Obtención de transgénicos por introducción de ADN a embrioblastos del blastocisto Es un método alternativo a la microinyección que produce transgénicos in­tegrales a partir de quimeras transgénicas. Se puede aislar los blastocistos del útero materno entre 3,5 y 4,5 días después de la cópula. Del blastocisto se ais­lan células troncales totipotentes (embrioblastos o blastómeros), que se culti­van sobre una capa de células que actúan de soporte. La introducción del ADN puede realizarse por infección con retrovirus u otros tipos de transfección como la mediada por liposomas.

Las células troncales manipuladas son reinsertadas en un nuevo blastocisto y éste en una madre pseudopreñada por tratamiento hormonal y apareamiento con machos vasectomizados. Al cabo de unos 18 días aparecerá la GO, cuyos individuos transgénicos serán todos quimeras, que por retrocruzamiento con los padres darán lugar a la F, que a su vez se analizará para detectar la presen­cia de hemicigotos transgénicos. Un cruzamiento entre hermanos F, dará lugar a homocigotos transgénicos que permitirán establecer una línea pura. Sólo aque­llos individuos cuyas células germinales hayan adquirido el gen inyectado en la GO serán transgénicos.

Para la infección con retrovirus se utilizan como células soporte, células productoras de retrovirus defectivos (derivados del virus Moloney de ratón) que lleven el transgén. La forma replicativa del retrovirus se integra en una sola copia, y si esto ocurre en células de la línea germinal, el provirus se transmite como un carácter mendeliano. A veces existen problemas con la expresión de genes introducidos en uno de estos vectores retrovíricos, debido a metilación de su ADN y, por tanto, bloqueo de su expresión. Las secuencias del hués­ped que flanquean el lugar de inserción del virus también son metiladas e inactivadas. Esta metilación puede desaparecer en períodos posteriores del de­sarrollo del animal, y la expresión variará dependiendo de la localización cro-mosómica donde se encuentre. Como la integración ocurre en un lugar distinto en cada embrioblasto, la expresión diferirá de célula a célula en el blastocisto receptor.

No siempre se controla el sexo de los embrioblastos donantes y receptores, por lo que se pueden añadir blastómeros masculinos a blastocistos de hembras, pro­vocando una quimera sexual en la que ocurrirá un cambio de sexo (XX —* XY), si las células XY forman la mayoría de los tejidos en el embrión que contribu­yen a la determinación del sexo. También puede aparecer un individuo herma-frodita con órganos sexuales masculinos y femeninos.

La utilización de células troncales totipotentes embrionarias tiene una ven­taja fundamental frente a la microinyección y es la posibilidad de seleccionar in vitro aquellas células que han incorporado el transgén, antes de su reincor­poración a un blastocisto. La selección nos permite obtener animales transgé-nicos producidos por recombinación homologa y dianas génicas, algo que no podemos llevar a cabo por microinyección en huevos fecundados.

Referencia: les debo la referencia del libro (por ahora no lo tengo a la mano)

Neurobiología y Neurobiogenética

La neurobiología estudia la evolución filogénica y ontogénica, referida a los cambios anatómicos, fisiológicos y bioquímicos, aplicados al desarrollo y la maduración normal del cerebro, por ende, las formas de aprendizaje y conducta en relación con el medio ambiente, expresadas en el concepto de plasticidad cerebral.

La neurogenética ha requerido de la neurobiología para estudiar la genética de los mamíferos, basada en estudios realizados en insectos, nemátodos, peces, anfibios, aves y en huéspedes de otros organismos. La neurogenética en relacion a la biologia molecular, ha tenido en los últimos 30 años un desarrollo extraordinario. Se ha estudiado el programa genético, la localización cromosómica, el secuenciamiento de los genes, la determinación de la función de las proteínas especificas del sistema nervioso, las técnicas de recombinación del DNA, las anormalidades cromosómicas, los aspectos genéticos de las enfermedades hereditarias, los métodos de diagnóstico, el estudio de los modelos animales y la producción de ingeniería genética (Mc Kusick, 1990).

En los últimos 16 años, la decodificación de la secuencia del DNA, representa el experimento biológico más importante en un programa internacional, denominado proyecto del genoma humano (Evans, 1998). EI genoma humano está compuesto por 3 billones de nucleótidos de DNA, organizado en los 23 cromosomas, representando un promedio de 60,000 a 70,000 genes con proteínas codificadas. Estos genes, constituyen sólo el 2 - 3% de la secuencia total de DNA, mientras que el 40% de la secuencia no tiene significado conocido y cl 58% es DNA no codificado, probablemente es responsable de funciones no determinadas o regula la expresión de los genes en los organismos complejos (Gabor-Mikolos, Rubin, 1996).

La expresión genética en tejidos específicos se conoce actualmente y el 50% de estos genes, son expresados en el cerebro, por lo cual, en algunas enfermedades cerebrales "degenerativas", los mecanismos bioquímicos por genes defectuosos pueden ser sometidos a terapia genética (Joynt, 1997).

Articulo tomado de:

Revista de la facultad de medicina Humana. Universidad Ricardo Palma. Facultad de Medicina Humana

Autor: Dr. Edmundo Beteta Pacheco

http://sisbib.unmsm.edu.pe/BVRevistas/